เรื่องราวต่อจาก ไอ้แมงมุม ภาค 1 หลังจากเวลาผ่านไปสองปี นับแต่ที่ ปีเตอร์ ปาร์กเกอร์ (โทบี้ แม็กไกวร์) หนุ่มนิสัยอ่อนโยน ได้เดินไปจาก แมรี่ เจน วัตสัน (เคิร์สเตน ดันสต์) หญิงสาวที่เขาหลงรักมานาน และเขานั้นได้ตัดสินใจที่จะปกป้องความสงบของประชาชนในฐานะ สไปเดอร์แมน ปีเตอร์ต้องเจอกับวายร้ายตัวใหม่อย่าง ด็อกเตอร์อ็อคโตปุส หรือ ผู้มีฉายาว่า ด็อค อ๊อคก์ (อัลเฟร็ด โมลีน่า) ที่มีพลังอย่างมหาศาล